进食行为受身体的稳态需求和食物的享乐值调节。容易获得可口的能量密集型食物以及随之而来的肥胖流行病股票配资网(晋)，都强调了对调节享乐喂养的神经回路的迫切需要。在这里，我们报道了外侧隔中的神经降压素阳性神经元 （LSNts） 在调节享乐喂养中起着至关重要的作用。沉默 LSNts 特异性地促进可口食物的摄食，而 LSNts 的激活会抑制整体进食。LSNts 神经元通过 GABA 信号投射到结核核 （TU） 以调节享乐进食，而来自 LSNts → 咽喉上核 （SUM） 的神经降压素信号足以抑制整体进食。体内钙成像和光遗传学作揭示了两个 LSNts 神经元群，它们在进食过程中被激活和抑制，分别有助于寻找食物和消费。LSNts 或 LSNts→TU 的慢性激活足以减少高脂肪饮食诱导的肥胖。我们的研究结果表明，LSNts→TU 是调节享乐喂养的关键途径。
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一、介绍
展开剩余98%在过去的几十年里，肥胖和相关代谢疾病的发病率迅速增加，并已成为全球主要的健康问题。肥胖大流行的一个主要驱动因素是现代社会大量可口的卡路里密集型食物造成的暴饮暴食。进食可以由能量需求驱动，这是一种进化上保守的机制，可以维持代谢稳态。这种稳态喂养受到大脑网络和循环激素活动的严格控制。另一方面，享乐喂养是由在没有代谢需求的情况下食用可口食物的乐趣驱动的，这是导致暴饮暴食和肥胖的主要因素。
尽管介导稳态喂养的神经回路已被广泛研究，但对调节享乐喂养的神经底物知之甚少。稳态和享乐喂养可以通过单独和不同的神经回路处理。下丘脑核，包括弓状核（ARC）和下丘脑外侧区（LHA），在介导稳态进食方面得到广泛认可，稳态进食将饥饿信号转化为食物寻求和消费。一般来说，享乐性喂养被认为是由中脑边缘多巴胺能奖励系统介导的，包括腹侧被盖区（VTA）及其靶标伏隔核（NAc）。然而，基因工程多巴胺缺乏的小鼠在出生后几周内停止进食并死亡，这表明 VTA 多巴胺系统在调节对动物生存很重要的行为（如稳态进食）中也起着至关重要的作用。此外，ARC 中表达 agouti 相关肽（AGRP）的神经元在控制稳态摄食方面具有很好的特征。AGRP 神经元消融消除了常规食物的消耗，但对生长素释放肽诱导的可口食物摄入没有影响。根据最近的一项研究，激活对 NAc 的室旁丘脑前（aPVT）输入可促进高脂肪食物的享乐喂养，但对过夜食物摄入量没有影响。这些研究表明，不同的神经回路可能对稳态和享乐喂养有不同的贡献。
外侧隔膜（LS）接收海马输入并向下丘脑发送大量投射；因此，它特别适合整合上下文信息，例如食物适口性，以指导摄食行为。先前的研究表明 LS 在调节一般喂养和压力诱导的焦虑方面具有潜在作用。然而，人们对 LS 细胞类型和回路如何促进享乐喂养知之甚少。
我们通过检查食用可口食物期间的大脑激活而没有能量不足，然后比较食用普通食物与可口食物期间的 LS 激活，来检查 LS 在享乐喂养调节中的参与。使用这种方法，我们在外侧隔（LSNts）中鉴定了在享乐喂养过程中被特异性激活的神经降压素表达 GABA 能神经元的子集。用破伤风神经毒素介导的突触失活或光遗传学方法沉默 LSNts 可特异性促进可口食物的喂养。然而，LSNts 的激活会抑制整体喂养。经典神经递质 GABA 和神经肽神经降压素都有助于 LSNts 神经元对摄食的调节作用。LSNts 通过 GABA 投射到结核核（TU）以调节享乐喂养，而 LSNts → 上颌核（SUM）的神经降压素信号足以抑制整体进食。精确分子、细胞类型和回路的鉴定可能有助于开发针对享乐喂养的新型疗法，用于治疗肥胖和相关代谢疾病。
二、材料和方法
2.1 动物
本研究中的所有饲养和实验程序均已获得动物护理和使用委员会的批准。本研究使用成年（3-5 个月大）雄性 C57BL/6 J 小鼠。将小鼠饲养在 22-25 °C 的昼夜节律中，昼夜节律为 12 小时光照和 12 小时黑暗周期。
2.2 病毒和试剂
我们购买了多种腺相关病毒（AAV）和试剂，包括 AAV2/9-hSyn-mCherry-P2A-TetTox-WPRE-pA、AAV2/9-hEF1a-DIO--hM3D（Gq）-mCherry-WPRE-pA 等。氯氮平 N-氧化物（CNO）购自 Enzo。CTB-488、CTB-555 和 CTB-647 购自赛默飞世尔。c-fos 抗体购自 Cell Signaling Technology。GFP 和 mCherry 抗体购自 Abcam。RNA 探针和 RNAScope 原位杂交试剂盒购自 ACDbio。
2.3 立体定向手术
小鼠腹膜内注射戊巴比妥（80 mg/kg）麻醉。进行标准手术，暴露 LS、POA、AHN、TU 或 SUM 上方的脑表面。用于 LS 注射的坐标为：前囟 +0.75 mm，侧侧 ±0.35 mm，硬脑膜 -2.85 mm。用于 POA 注射的坐标为：前囟 +0.62 mm，侧向 ±0.25 mm，硬脑膜 −4.25 mm。用于 AHN 注射的坐标为：前囟 -0.80 mm，外侧 ±0.40 mm，硬脑膜 -5.0 mm。用于 TU 注射的坐标为：前囟 -1.94 mm，外侧 ±1.20 mm，硬脑膜 -5.10 mm。用于 SUM 注射的坐标为：前囟 -3.0 mm，外侧 ±0.25 mm，硬脑膜 -4.4 mm。用连接到纳米升注射器的玻璃移液器以 60 nl/min 的慢流速立体定位注射 AAV 载体和 CTB-488/594/633，以避免对局部脑组织的潜在损伤。病毒注射后至少 10 分钟撤回移液器。
对于突触灭活和化学遗传学激活实验，所有注射均为双侧。在病毒注射后 3 周进行行为测试。对于通路追踪实验，AAV 和 CTB 注射在同一侧单侧。注射后 1 周（CTB）或 3 周（AAV）进行组织学分析。对于光遗传学作、光纤光度法和钙成像实验，AAV 注射是单侧的，然后是光纤或微型显微镜植入。
2.4 光纤和微型显微镜植入
AAV 注射后 30 分钟，将带有光纤的陶瓷套圈植入 LS、TU 或 SUM。然后用光固化树脂将密封垫圈固定在颅骨上。植入后，缝合皮肤，并在手术伤口上涂抹抗生素。光遗传学和光纤光度法实验在光纤植入后至少 3 周进行。
微型显微镜手术程序如前所述。AAV-DIO-GCaMP6 AAV 注射后 3 周，GRIN 镜片植入晶状体尖端位于 LS 顶部。然后用光固化树脂将晶状体固定在颅骨上。在 GRIN 晶状体植入后 3 周连接底板。行为实验在从底板附着恢复后至少 1 周开始。
2.5 行为测试
病毒注射或纤维植入后，将小鼠分组饲养至少 3 周，然后进行行为测试。在行为测试前至少 3 天，实验者每天处理它们。所有行为均由实验者评分，他们对动物的治疗视而不见。所有行为实验在实验室中至少重复 3 次。
2.6 固体食物摄入量测定
在固体食物摄入测定前至少 3 天将小鼠单独饲养。在摄食行为实验中，每天更换不同种类的食物（标准食物、高蔗糖食物或高脂肪食物，~20 g），并每天更换笼子以防止食物残渣聚集在底部。在早期黑暗阶段（晚上 8：00-10：00），通过在笼子中短暂取出食物并测量其重量，在家笼中手动计算食物摄入量。热量摄入是根据负担表计算的。为避免改变饮食引起的压力的潜在影响，小鼠适应新饮食至少 3 天。
对于 c-fos 标测实验，在有或没有能量损失的情况下进行饲喂实验。对于对照喂养组，小鼠用标准实验室随意食物喂养。对于享乐喂养组，小鼠可以无限制地获得标准食物，而高蔗糖食物每天提供 2 小时，连续 7 天。监测这 2 小时内的食物摄入量。对于急性能量不足诱导的摄食，将食物去除 22 小时（禁食组），然后提供标准食物（禁食 + 食物组）或高蔗糖食物（禁食 + HSF 组）。实验在实验室中重复 3 次。
对于 TeNT 诱导的突触失活和 CRISPR/Cas9 介导的敲低实验，如上所述，在饱腹或禁食状态下依次测量不同种类食物的摄入量。
对于化学发生激活实验，在腹膜内注射生理盐水（0.9%；200 μl）或 CNO（2 mg/kg 体重，盐水中）。在饱腹或禁食状态下依次测量不同种类食物的摄入量。
2.7 液体食物摄入量测定
对于游离流质食物摄入测定，实验前将小鼠单独关在笼子里，随意进食和水。在实验过程中，将小鼠置于作调节室（22 cm × 16 cm × 15 cm）。每 10 秒输送一滴（10 μl）液体（水、10% 蔗糖溶液、Ensure 或淀粉溶液），重复序列 180 次。液体由装有液体注射器的泵推出。舔舐由带有电容式触摸传感器和微控制器的定制舔舐计监控。从第 1 天到第 3 天，训练小鼠舔嘴。对于 TeNT 诱导的突触失活实验，训练 3 天后，在第 4 天测量不同液体的消耗量。对于化学遗传学活化实验，小鼠在第 4 天随机分为两组，并在测试前 30 分钟用生理盐水或 CNO（2 mg/kg 体重的生理盐水中，IP）处理。第二天（第 5 天），相反，用 CNO 或生理盐水处理小鼠并再次测试。对于光遗传学抑制实验，使用 593 nm 二极管泵浦固态激光系统产生 593 nm 蓝色激光进行光刺激。FC/PC 适配器用于将激光的输出连接到植入的套圈以进行颅内光传输。第 4 天，将小鼠置于行为室中，并在关灯时测量流质食物的消耗量。第 5 天，将小鼠置于同一腔室中进行摄食测定，同时在整个喂养过程中持续提供黄光刺激（593 nm）。
对于液体（Ensure、常规流质食物、水）的提示条件喂养，试验开始后每 1-20 秒出现一次 20 秒的听觉提示（24 kHz）。在提示呈现后，立即由装有含液体注射器的泵推出一滴（10 μl）液体食物。舔舐由带有电容式触摸传感器和微控制器的定制舔舐计监控。
对于流质食物的自定进度自由喂食，小鼠在每次自定进度的喂食过程中可以通过舔舐计喷口自由接触 Ensure 30 分钟。一旦检测到舔舐，就输送一滴（10 μl） Ensure。每个自定进度的消费会话通常包含多个消费回合。每场比赛被定义为连续舔舐，舔间间隔小于 6 秒。神经元动力学与每轮比赛的第一次提对齐以进行进一步分析。
对于不同喂养阶段的光遗传学作，蓝光（473 nm）在接近或消耗阶段以 20 Hz（20 ms 脉冲持续时间）传递，而黄光（593 nm）在接近或消耗阶段持续施加。
2.8 空场试验
在行为测试当天，将小鼠转移到测试室，并在实验开始前适应室内条件 3 h。用 20% 乙醇清洁设备以消除其他小鼠的气味。将小鼠置于塑料旷场室（40 × 40 cm）中。使用定制的 MATLAB 跟踪软件以 30 Hz 采样频率监测小鼠位置。该腔室在概念上分为中央视野（25 × 25 cm）和外围视野以进行分析。分析了总运动和在中心花费的时间比率。
对于急性化学遗传学活化实验，将小鼠随机分为两组，并在试验前 30 分钟用生理盐水或 CNO（2 mg/kg 体重的生理盐水中，IP）处理。让小鼠自由探索 10 分钟。第二天，用 CNO 或生理盐水相反地处理小鼠并再次检测。对于慢性化学遗传学激活实验，小鼠在试验前未接受 CNO 治疗。
对于光遗传学抑制实验，将小鼠置于腔室中，并给予黄光刺激（593 nm，连续光，5 min ON 和 5 min OFF 交错）20 min。
2.9 体重和生理参数测量
2.9.1 体重测量
注射病毒后，将小鼠分组（每个笼 3-5 只动物），喂食标准食物。3 周后，每天测量体重。对于 TeNT 诱导的突触失活实验，小鼠用标准食物喂养或改用高脂肪食物。对于化学遗传学激活实验，不同组用标准食物喂养或改用高脂肪食物。CNO（1 mg/kg 生理盐水，IP）每天注射两次。
2.9.2 能量消耗测量
使用安装在恒定环境温度（22-25 °C）和 12 小时光照、12 小时黑暗循环下的间接量热系统测量能量消耗。每个腔室中的老鼠都可以自由获得食物和水。
2.9.3 血糖测量
为了测量血糖，用剃须刀片在末端水平切割小鼠尾巴，并收集一小滴血。然后使用血糖仪测量血糖水平。对于化学发生激活实验，首先在光周期的暗相开始时测量基础血糖水平。注射 CNO（2 mg/kg 体重的生理盐水，IP）后，30 分钟后测量血糖水平。在血糖测量期间没有提供食物。对于 TeNT 诱导的突触失活实验，在禁食过夜（16 h）后测量空腹血糖。然后这些禁食小鼠通过管饲法接受口服剂量（1.5 g/kg）的 30% D-葡萄糖溶液。在基线和葡萄糖给药后 10 、 30 、 60 、 90 和 120 分钟采集血液。
2.9.4 血压和心率测量
对于血压和心率测量，采用了 BP-2000 血压分析系统并遵循用户指南。BP-2000 使用透射光电容积脉搏波，其中分析通过尾部传输的光量的变化以确定血压和脉搏率。在开始正式实验之前，动物首先习惯了 3 天的血压测量。测量在每天的下午 2 点至 4 点进行。在进行测量前 1 到 2 小时将小鼠转移到安静的测量室。轻柔地处理小鼠，以使它们尽可能保持冷静。将动物放在支架内，将袖带套在尾巴上，然后将尾巴放在传感器中 V 形凹槽的底部。为了让动物充分热身以在尾巴中产生良好的血液流动，并让它们习惯在标本架中，在每次实际测量开始之前，至少进行了 5 次初步测量。每次会议进行 10 到 20 次实际测量。
对于化学遗传学激活实验，在习惯化 3 天后测量基础血压和心率。第二天的同一时间，注射 CNO 后再次测量血压和心率（2 mg/kg 体重盐水，IP）。
2.9.5 直肠温度测量
为了测量直肠温度，使用了温度计。首先，将凡士林放在温度计探头的末端。在直肠温度采集过程中，用两根手指固定小鼠尾巴的底部，然后轻轻抬起，同时动物用前爪抓住笼盖上的金属棒，从而暴露肛门生殖器区域。清洁排泄物和尿液，以尽量减少排尿或排便的混杂影响。然后将带有凡士林的探针插入肛管 1.5 厘米，稳定后读取温度。在收集正式数据之前，至少连续 3 天测量直肠温度。对于化学遗传学实验，在注射 CNO（2 mg/kg 体重，IP）。
2.10 光纤光度法
在 AAV-GCaMP6s 注射后至少 3 周进行纤维光度实验。植入的光纤通过光纤跳线（200 μm，0.37 NA）连接到 Fiber Meter。为了记录荧光信号，来自 480 LED 的光束被二向色镜反射，用耦合到 CMOS 检测器的透镜聚焦。跳线尖端的 LED 功率小于 50 μW。
在提示条件或自定进度进食期间记录感染 GCaMP6s 的小鼠的 LSNts 神经元钙活性。舔舐信号通过自制的舔舐计收集，并由光纤计采集。使用自定义编写的 MATLAB 代码对信号进行分析。荧光变化（ΔF/F）计算为（F-F0）/F0，其中 F0 是基线荧光信号（第一次舔舐或提示开始前 -6 至 -4 秒）。曲线下面积（AUC）计算为事件的平均 ΔF/F，食物接近阶段为 -6 至 0 s，食物消费阶段为 0 至 8 s。
为了记录 LSNts→TU 或 LSNts→SUM 的 Ca2+，将 AAV-Retro-DIO-GCaMP6s 注射到 TU 或 SUM 中，并在 Nts-ires-Cre 小鼠的 LS 处植入光纤。为了消除基线漂移的影响，按照 Xiao 等人的描述对原始荧光迹线进行了校正。基线漂移校正后，荧光信号在第一次舔开始前的 -6 至 -4 s 的时间窗内相对于信号的平均值和标准差进行 z 评分。
带有底板和连接的微型显微镜的小鼠在成像前至少 3 天习惯于成像行为室（35 cm × 30 cm）。成像数据以 30 Hz 帧速率和 15%–35% 的 LED 功率采集。钙成像数据由 UCLA Miniscope-DAQ-DT-Software 收集。微型显微镜与行为相关事件（舔舐和抽吸事件）之间的同步是通过定制的 Arduino 板实现的。
钙成像时间序列的分析是在 Python 和 MATLAB 中进行的。成像数据在空间上被下采样（在 x-y 中为 2 倍）和时间上被下采样（4 倍）。用于显微内窥镜检查的约束非负矩阵分解（CNMF-E）用于从处理的数据中提取与单个神经元相关的 GCaMP 荧光反应。简而言之，我们通过 CNMF-E 估计了单个神经元的反应，并手动删除了明显的非神经对象，这些对象通常具有不切实际的小（1-5 像素）或大（超过 100 像素）胞体大小。
在传统的钙成像中，荧光信号被比作 ΔF/F。我们使用检查的 CNME-F 原始输出作为 ΔF 进行后续分析。为了报告会话中神经元的平均荧光响应，标准化 ΔF 计算为（ΔF − ΔF基线）/（ΔFmax − ΔFmin）。ΔF基线是试验的 -6 至 -4 s 平均反应。
首先通过 MATLAB 中的线性曲线拟合估计 Ca2+ 响应半宽和回合持续时间。反应半宽与回合持续时间之间的相关系数用 MATLAB 函数 'corrcoef' 计算。
为了比较一次会议中对不同食物的反应，在多个试验中对每个神经元的 ΔF 进行平均。然后根据此平均响应计算 z 分数。
为了将 Ca2+ 反应在消耗过程中分为“兴奋”或“抑制”，首先根据每次试验的 -6 至 -4 秒的 ROI 平均荧光信号计算基线值。根据每次试验峰值附近 ±1 s 的平均荧光信号计算峰值响应。对所有试验的基线值和峰值反应进行统计比较（Wilcoxon 符号秩检验）。如果 p < 0.05，则该细胞被归类为兴奋性反应，并且具有阳性峰值反应。如果 p < 0.05，则该细胞被归类为抑制性反应，并且具有负峰值反应。如果 p > 0.05，则该细胞被归类为无反应。
2.11 电生理记录
准备急性脑切片和用光遗传学刺激进行全细胞记录的程序与前面描述的程序相似。使用振动切片机在含有（mM）110 氯化胆碱、2.5 KCl、0.5 CaCl2、7 MgCl2、1.3 NaH2PO4、1.3 Na-抗坏血酸钠、0.6 Na-丙酮酸钠、25 葡萄糖和 25 NaHCO3 的冰冷胆碱溶液中制备含有 LS 或 TU 的冠状 250-300 μm 切片，饱和有 95% O2 和 5% CO2。切片在 32 °C 含氧人工脑脊液（以 mM 为单位：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1.3 MgCl2、1.3NaH2PO4、1.3 Na-抗坏血酸、0.6 Na-丙酮酸、25 葡萄糖和 25 NaHCO3）中孵育至少 1 小时记录前。将切片转移到记录室中，并用 2 ml min -1 人工脑脊液超级融合。从硼硅酸盐玻璃中提取的贴片移液管（2–5 MΩ）填充含有（以 mM 为单位）135 CsMeSO3、10 HEPES、1 EGTA、3.3 QX-314、4 Mg-ATP、0.3 Na-GTP、8 Na2-磷酸肌酸、290 mOsm kg-1 的 Cs 基低 Cl– 内部溶液，用 CsOH 调节至 pH 7.3。在室温下使用 Multiclamp 700B 放大器和 Digidata 1440 A 进行全电池电压钳记录。以 10 kHz 对数据进行采样，并使用 Clampfit 或 MATLAB 进行分析。由来自 Digidata 1440 A 的数字命令控制的蓝色发光二极管（470 nm）用于提供光刺激。为了记录光诱发的 IPSC，蓝光脉冲（473 nm，1 ms，0.5~2 mW）通过光纤传输以照亮整个视场。在 CNQX（10 μM）存在下，以 0 mV 的保持电位记录 IPSC。为了封闭 IPSC，通过灌注系统将苦味菌毒素加入记录室并孵育至少 5 分钟。
2.12 组织学作
对于 c-fos 免疫染色实验，在进食开始后 90 分钟处死小鼠。对于 c-fos RNAScope 原位杂交实验，在进食开始后 30 分钟处死小鼠。对于化学遗传学活化实验的验证，在处死动物前 0.5 小时给予 CNO（2 mg/kg 体重的盐水，IP）。用过量的戊巴比妥钠对小鼠实施安乐死，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）经心脏灌注，然后在 PBS 中加入 4% 多聚甲醛（PFA）。将大脑在 4% PFA 的 PBS 溶液中后固定 16-24 小时，并在 30% 蔗糖中脱水 24-48 小时，直至沉入底部。切片前将组织包埋在干冰上的 Tissue-Tek OCT 化合物中。用低温恒温器将大脑切成 40 μm 的切片。将自由漂浮的冷冻切片收集在 PBS 中。首先在 PBS 中洗涤脑切片（3 ×10 分钟），然后在室温下用 10% 正常山羊血清（GS）/0.3% Triton X-100（PBST）封闭，然后与一抗（兔抗 c-fos）在 4 °C 下孵育过夜。在 PBST 中洗涤脑切片（3 × 10 分钟），然后用荧光团偶联的二抗（1：1000 在 5% GS PBST 中）孵育 2 小时，最后用 DAPI（1：3,000）复染。
对于原位 RNA 杂交，用低温恒温器将小鼠大脑切成 18 μm 的切片，并安装在 SuperFrost Plus 显微镜载玻片上。靶向 c-fos、Nts、Penk、Crhr2、vGAT 和 vGluT2 的探针由 Advanced Cell Diagnostics 设计和验证。根据制造商的方案，RNAscope v2 检测用于所有 FISH 实验。简而言之，将脑切片在 39 °C 下干燥 2 小时，用 1x PBS 冲洗，用 3% 过氧化氢的甲酮溶液处理，TR 缓冲液处理 15 分钟，用 RNAScope 蛋白酶 III 在 40 °C 下处理 15 分钟。将脑切片与 mRNA 探针在 40 °C 下孵育 2 小时。然后用多重隐含缓冲液扩增特异性信号，并用 TSA Plus Flucerence 试剂盒检测。
使用奥林巴斯虚拟载玻片显微镜获得图像，并由对实验组身份不知情的个体进行分析。细胞计数是使用定制编写的 MATLAB 软件完成的，如下所述。
2.13 细胞计数
为了计算 c-fos + 、 Nts + 、 Penk + 、 Crhr2 + 和 CTB + 细胞的数量，我们为每只小鼠收集了目标脑区的 40 μm 冠状切片。使用载玻片扫描仪采集图像，然后使用定制编写的 MATLAB 软件进行细胞计数。
2.14 统计学
使用 GraphPad Prism 或 Matlab 进行统计分析。没有使用统计数据来确定样本量。
三、结果
3.1 全脑 c-fos 标测揭示了享乐喂养诱导的 LS 中神经降压素阳性神经元的激活
我们采用了一种限制可口的食物喂养方案，该方案诱导了在不禁食的情况下大量食用可口的食物。这种喂养方案包括每天间歇性地摄入高蔗糖食物 2 小时，而始终提供标准的实验室食物。小鼠在这 2 小时期间发展了稳定的食物摄入量，而在此期间可以随意获得标准食物的对照小鼠吃得很少（图1D）。食物摄入量主要限于可口的食物，这表明进食主要是由食物的适口性驱动的——这是享乐进食的标志。
图 1.LS 中的 nts 阳性神经元在享乐喂养期间被激活。A LS 在摄入高蔗糖食物期间被激活，没有能量不足。左图：对照小鼠（随意获得标准食物，n = 10）和享乐喂养小鼠（间歇性获得高蔗糖食物以及随意获得标准食物，n = 10）在 2 小时内测量的食物摄入量。Mann-Whitney U 检验。P < 0.0001。中图：对照 （n = 10） 和享乐喂养小鼠 （n = 10） 的 LS 中 c-fos + 神经元的数量。Mann-Whitney U 检验。P < 0.0001. 右图：对照和享乐喂养小鼠 LS 中 c-fos 免疫染色的代表性图像。比例尺：100 μm。B 当小鼠在禁食后食用高蔗糖食物 （HSF） 时，LS 显示出优先激活。左图：禁食过夜后，标准食物 （n = 8） 或高蔗糖食物 （n = 8） 在 2 小时内测量的食物摄入量。Mann-Whitney U 检验。P < 0.0001。中图：禁食组、禁食组 + 食物组和禁食 + HSF 组 LS 中 c-fos + 神经元的数量。单因素方差分析（F（2， 21） = 6.558，P < 0.01），然后是 Tukey 事后检验。ns，无显著差异，*P < 0.05，**P < 0.01。右图：禁食组、禁食组 + 食物组和禁食 + HSF 组在 LS 中 c-fos 免疫染色的代表性图像。比例尺：100 μm。C c-fos（绿色）和 Nts（红色）的双重原位杂交实验的代表性图像。比例尺：100 μm。D c-fos（绿色）和 Penk（红色）的双重原位杂交实验的代表性图像。比例尺：100 μm。 E c-fos（绿色）和 Crhr2（红色）的双重原位杂交实验的代表性图像。比例尺：100 μm。F c-fos + 群体中 Penk + 、 Crhr2 + 和 Nts + 细胞的百分比：Penk + / c-fos + = 19.7 ± 2.5%，Crhr2 + / c-fos + = 13.5 ± 1.3%，以及 Nts + / c-fos + = 57.6 ± 2.5%。单向方差分析 （F（2,14） = 43.71，P < 0.01），然后是 Tukey 事后检验。***P < 0.001 和 ****P < 0.0001。均值 ± s.e.m. G Nts（红色）和 vGAT（绿色）的双重原位杂交实验的代表性图像。比例尺：100 μm。H在vGAT+群体中的Nts+细胞百分比和在Nts+群体中vGAT+细胞的百分比：（Nts+ & vGAT+）/vGAT+ = 21.3 ± 3.8%，（Nts+ & vGAT+）/Nts+ = 100%，以及（Nts+ & vGluT2+）/Nts+ = 1.38 ± 0.5%。
我们对 c-fos（近期神经元活动的标志物）进行了免疫染色，以检查整个大脑中享乐喂养激活的神经元。享乐喂养激活了多个大脑区域，包括丘脑室旁核（PVT）、LS、扣带皮层（Cg）、SUM、岛叶、海马体（Hipp）、导水管周围灰质（PAG）、腹侧被盖区（VTA）、腹侧外侧膝状核（VLGMC）、TU 和不定带（ZI）。其中，PVT 和 LS 显示最高的 c-fos 表达。
当动物食用可口的食物时，参与享乐喂养的神经元应该更加活跃。然后，我们比较了禁食过夜后食用可口食物与普通食物的小鼠在 PVT 和 LS 中的 c-fos 表达水平。当小鼠食用高蔗糖食物和普通食物时，PVT 显示相似水平的 c-fos 表达，而小鼠食用可口食物后 LS 显示优先激活。因此，LS 可能在调节享乐喂养方面发挥独特作用。
LS 包含由不同分子标志物定义的各种神经元群。为了确定由享乐喂养激活的 LS 神经元的分子身份，我们对编码 c-fos 的 mRNA 和 LS 神经元标志物神经降压素（Nts）、脑啡肽原点蛋白（Penk）和促肾上腺皮质激素释放因子（Crhr2）进行了 RNAScope 双荧光原位杂交（dFISH）。RNAScope 显示，57.6% ± 2.5% 的享乐喂养激活的 LS 神经元是 Nts 阳性，而只有 19.7% ± 2.5% 是 Penk 阳性，13.5% ± 1.3% 是 Crhr2 阳性。享乐喂养激活的 c-fos+ 细胞从喙部分布到尾部 LS，这与 Nts 的表达模式相似。我们还用神经降压素和囊泡 GABA 转运蛋白（vGAT）（GABA 能神经元的标志物）或囊泡谷氨酸转运蛋白 2（vGluT2）（隔膜区域谷氨酸能神经元的标志物）的探针进行了 dFISH。大约所有 Nts 阳性神经元也是 vGAT 阳性，而 Nts 阳性神经元占 LS 中 GABA 能神经元的 ~21%（图 1G， H）。
3.2 沉默 LSNts 神经元促进可口食物的享乐喂养
我们采用 Cre 依赖性腺相关病毒（AAV）介导的表达策略来特异性纵 LSNts 神经元的活性，并研究 LSNts 神经元在享乐喂养中的功能。通过将携带双氟 EGFP（AAV-DIO-EGFP）的 AAV 注射到 Nts-ires-Cre 小鼠的 LS 中，我们证实其表达仅限于 LS 中的 Nts 阳性神经元。然后，我们使用了破伤风神经毒素（TeNT），这是一种通过裂解突触蛋白-2 来阻断神经递质释放的蛋白酶，突触蛋白-2 被广泛用作突触沉默的分子工具。为了验证 TeNT 诱导的突触沉默的效率，我们将表达通道视紫红质-2（ChR2）的 Cre 依赖性 AAV 与增强的绿色荧光蛋白（EGFP）一起注射到作为对照或破伤风神经毒素（TeNT）中用于突触沉默的 Nts-ires-Cre 小鼠的 LS 中。在表达 EGFP 的对照小鼠制备的 LS 切片中，表达 ChR2 的 LSNts 神经元的光刺激在所有相邻的 ChR2 阴性 LS 神经元中诱发了强大的毛毒素敏感抑制性突触后电流（IPSC）（7/7）。TeNT 的表达几乎完全阻断了 LSNts 神经元的突触传递。引人注目的是，LSNts 神经元突触输出的沉默强烈促进了在随意条件下食用可口的高蔗糖和高脂肪食物，而不是标准食物的消费。在 2 小时和 24 小时的饲喂期间都观察到这种产食欲效应。然而，在禁食小鼠中，当稳态需求成为进食的主要驱动力时，TeNT 表达对食物摄入没有影响，无论食物类型如何。我们还检查了 TeNT 表达对液体食物摄入的影响，在免费输送少量、固定体积（10 μl）可口的蔗糖溶液或使用配备舔洁计的电动舔口 Ensure 期间。TeNT 表达还显著促进了可口液体食物的摄入，包括蔗糖溶液和 Ensure，但不促进水的摄入。我们还采用了一种具有卓越时间精度的光遗传学方法来沉默 LSNts 神经元。与 TeNT 介导的突触沉默一致，LSNts 神经元的光遗传学沉默大大增加了可口 Ensure 的摄入量，这发生在光照后立即发生（图2D）。总之，这些结果揭示了 LSNts 神经元在调节享乐喂养中的重要作用。
图 2.LSNts 神经元的沉默促进了可口食物的享乐进食。左图：示意图显示将 AAV-DIO-TeNT 注射到 LS 中以使 LSNts 神经元突触沉默。右图：Nts-ires-Cre 小鼠 LS 中注射部位和病毒表达的代表性图像。比例尺：500 μm。B 代表性图像显示了 LSNts 神经元中 ChR2（红色）和 TeNT（绿色）的表达。比例尺：500 μm（上面板），20 μm（下面板）。C 示意图显示了用于记录 LSNts 神经元光遗传学刺激诱导的 LS 切片中突触后电流的实验。在 ChR2 与 EYFP 共表达的切片中，蓝光刺激诱发了强大的 IPSC（灰色痕迹），该 IPSC 被毛霉毒素（红色痕迹）阻断。在 ChR2 与 TeNT 共表达的切片中，蓝光刺激未能诱发 IPSC （绿色轨迹）。D 表达 TeNT （n = 6 个细胞） 和表达 EYFP （n = 7 个细胞） 小鼠中光诱发 IPSCs 振幅的统计数据。双向方差分析（F（1,11） = 53.46，P < 0.0001），然后是 Sidak 的事后检验。***P < 0.0001。均值 ± SEM E EYFP-（灰色条，n = 6）和表达 TeNT 的小鼠（绿色条，n = 8）中 2 小时固体食物摄入量的定量。上图：在随意条件下，TeNT 表达增加了高蔗糖和高脂肪食物的摄入量，但不增加了标准食物的摄入量。下面板：TeNT 表达对禁食条件下的食物摄入没有影响。Mann-Whitney U 检验。P < 0.001。均值 ± SEM F 通过 EYFP-（灰色条，n = 6）和表达 TeNT 的小鼠（绿色条，n = 8）对 2 小时流质食物摄入量的定量。 TeNT 表达增加了可口流质食物的摄入量，但不增加了水的摄入量。EYFP-（灰色，n = 6）和表达 TeNT 的小鼠（绿色，n = 8）的代表性舔舐行为（左图）、累积舔水（中图）和总摄入量（右图）、蔗糖溶液（中图）和 Ensure （下图）。Mann-Whitney U 检验。**P < 0.01 和 ****P < 0.0001。均值 ± s.e.m. G 定量 EYFP-（灰色条，n = 7）和 TeNT 表达（绿色条，n = 7）小鼠的体重变化。左图：代表性图像显示了高脂肪饮食喂养 6 周后表达 EYFP 和 TeNT 的小鼠。右图：TeNT 表达促进喂食高脂肪饮食的小鼠体重增加，但不是标准食物。Mann-Whitney U 检验。ns，无显著差异，*P < 0.01，***P < 0.001。指 ± s.e.m.
LSNts 沉默对可口食物摄入的强烈影响表明能量平衡可能受到干扰；然后我们检查了运动活动和能量消耗。在旷场试验中，光遗传介导的神经元抑制或 TeNT 介导的 LSNts 突触沉默对小鼠的一般运动活动没有影响。TeNT 表达不会改变小鼠在代谢笼中的能量消耗。与这些结果一致，TeNT 表达显着增加了喂食高脂饮食 3 周的小鼠的体重。然而，在喂食普通食物的小鼠中未观察到这种体重增加。这些结果证实了 LSNts 神经元在调节享乐喂养和体重中的关键作用。
3.3 LSNts 神经元的激活抑制整体进食
我们接下来检查了 LSNts 神经元激活对食物摄入的影响。我们将表达兴奋性设计受体（DREADDs）hM3D 或 mCherry 的 Cre 依赖性 AAV 注射到 Nts-ires-Cre 小鼠的 LS 中（图3D）。三周后，腹膜内注射 CNO（2 mg/kg），但不是生理盐水，导致 hM3D 表达的 LS 神经元中强大的 c-fos 表达。在随意条件下，LSNts 神经元的化学遗传学激活强烈减少了食物摄入，无论食物类型如何。然而，在禁食条件下，LSNts 神经元的激活仅减少了可口的高脂肪和高蔗糖食物的摄入，而不是标准食物的摄入。LSNts 神经元的激活也抑制了可口液体食物的摄入，包括蔗糖溶液和 Ensure。LSNts 神经元的化学遗传学激活对小鼠的一般运动活动没有影响。纵 LSNts 神经元的活性对旷场试验中的焦虑相关行为没有影响，并且对血压、体温、血糖水平或心率没有影响，表明 LSNts 神经元在调节摄食中的特定作用。
图 3.LSNts 神经元的激活抑制了整体进食。左图：示意图显示将 AAV-DIO-hM3D 注射到 LS 中以激活 LSNts 神经元的化学发生学。右图：Nts-ires-Cre 小鼠 LS 中注射部位和病毒表达的代表性图像。比例尺：500 μm。B 左图：代表性图像显示 CNO 注射 （2 mg/kg） 在表达 hM3D 的小鼠中诱导 LSNts 神经元的稳健 c-fos 表达。比例尺：100 μm。右图：“hM3D + 盐水”（n = 4）、“EYFP + CNO”（n = 4） 和“hM3D + CNO”（n = 4）组的 LSNts 神经元中 c-fos + 细胞的百分比。单向方差分析 （F（2,9） = 684.5，P < 0.001），然后进行 Dunnett 事后检验。****P < 0.0001。C 表达 mCherry 和 hM3D 的小鼠注射生理盐水（灰色条）和 CNO（红色条）后 2 小时固体食物摄入量的定量。上图：在表达 hM3D 的小鼠 （n = 6） 中，CNO 注射减少了随意条件下的食物摄入量，但没有减少表达 mCherry 的小鼠 （n = 5）。双向方差分析（标准食物，F（1,18） = 8.202，P < 0.05;高蔗糖食物，F（1,18） = 9.941，P < 0.01 ;高脂肪食物，F（1,18） = 19.27，P < 0.001）， 然后是 Sidak 事后检验。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。下图：在表达 hM3D 的 （n = 6） 中，CNO 注射减少了禁食条件下高蔗糖和高脂肪食物的摄入量，但 不是表达 mCherry 的小鼠 （n = 5）。双向方差分析（标准食物，F（1,18） = 0.9784，P > 0.05;高蔗糖食物，F（1,18） = 5.234，P < 0.05 ;高脂肪食物，F（1,18） = 6。 420，P < 0.05），然后是 Sidak 的事后测试，***P < 0.001，意味着 ± SEM D CNO 注射减少了表达 hM3D 的小鼠 （n = 7） 而不是表达 mCherry 的小鼠 （n = 5） 减少了蔗糖溶液（上图）和 Ensure （下图）的总摄入量。 蔗糖解决方案：双向方差分析（F（1,20） = 7.96，P < 0.05），然后是 Sidak 事后检验。***P < 0.001。确保：双向方差分析（F（1,20） = 15.70，P < 0.001），然后是 Tukey 事后检验。****P < 0.0001。 指 ± s.e.m.
3.4 GABA 和神经降压素信号转导差异调节享乐和整体喂养
我们的结果表明，沉默 LSNts 神经元特异性地促进了享乐进食，而 LSNts 神经元的激活抑制了整体进食。我们想知道来自 LSNts 神经元的不同信号是否可能对享乐特异性和整体喂养进行差异化调节。在基础生理活性水平上，GABA 被释放并作用于突触后神经元，因为我们在 LSNts 的短暂光遗传学刺激（1 ms）后在局部突触后神经元中记录了对毛毒素敏感的 IPSC。在强烈的成化激活后，在 CNO 注射后的下游区域检测到神经降压素肽。因此，我们假设在基础活性水平上释放 GABA 会抑制享乐喂养，而神经降压素在强烈的 LSNts 激活后被进一步募集以抑制整体喂养。
为了验证这一假设，我们使用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑来敲低 LSNts 神经元中的 GABA 或神经降压素释放。我们设计了一种靶向囊泡 GABA 转运蛋白（vGAT）的单向导 RNA（sgRNA），它负责将 GABA 包装到突触囊泡中，对 GABA 能突触传递是必不可少的，以减少 GABA 的释放。将 Nts-ires-Cre 小鼠与 Cre 诱导的 Cas9 敲入小鼠杂交后，我们将携带 vGAT 靶向（sgRNA）和 Cre 诱导的 hM3D-mCherry 的 AAV 注射到 LS 中，以在 vGAT 敲低细胞中表达 hM3D。为了验证 vGAT 敲低的效率，我们还将 AAV-DIO-ChR2 注射到 vGAT 敲低动物的 LS 中，并记录了来自突触后神经元的 IPSC。短暂的蓝光刺激（1 ms）在对照 LacZ sgRNA 动物的所有记录神经元（8/8）中诱发了强大的 IPSC。然而，相同的光刺激未能在来自 vGAT 敲除动物的所有记录的神经元（0/8）中诱发任何 IPSC。这些结果表明，我们的 CRISPR/Cas9 策略在破坏 GABA 信号传导方面非常有效（图4）。
图 4.GABA 和神经降压素信号传导差异调节享乐和整体喂养。A 示意图显示了 CRISPR/Cas9 介导的 vGAT 和 Nts 敲低的实验设计。将编码 vGAT 靶向、Nts 靶向或对照 LacZ 靶向 sgRNA 和 Cre 诱导型 hM3D 的 AAV 注射到小鼠与 Cre 诱导型 Cas9 敲除杂交的 Nts-ires-Cre 小鼠中。B 示意图显示了验证 vGAT 敲低的实验设计。在 LacZ 对照或 vGAT 敲低小鼠中，ChR2 在 LSNts 神经元中表达，并在相邻的 Nts 阴性神经元上进行全细胞膜片钳记录。C LacZ 对照（灰色）和 vGAT 敲除（红色）小鼠在不同光功率（从左到右：0.5 mW、1.0 mW、1.5 mW、2.0 mW）下光诱发 IPSCs 的代表性痕迹。D LacZ 对照（灰色，n = 8 个细胞）和 vGAT 敲除（红色，n = 8 个细胞）小鼠中光诱发电发的 IPSCs 振幅的统计数据。双向方差分析（F（1,14） = 50.87，P < 0.0001），然后是 Sidak 的事后检验。**P < 0.01 和 ***P < 0.0001，表示 ± s.e.m. E LacZ 对照（黄色，n = 11）、vGAT 敲低（红色，n = 9）和 Nts 敲低（蓝色，n = 13）小鼠的基线食物摄入量（左图：标准食物，右图：高蔗糖食物）。单因素方差分析（标准食物，F（2,230） = 1.716，P > 0.05;可口食物，F（2,30） = 6.563，P < 0.01），然后是 Tukey 事后检验。ns，无显著差异，*P < 0.05。 指 ± s.e.m. F LacZ 对照 （n = 11）、vGAT 敲低 （n = 9） 和 Nts 敲低 （n = 13） 小鼠对 LSNts 神经元化疗发生学激活对食物摄入量（左图：标准食物，右图：可口食物）的影响。双向方差分析（标准食物，F（2,60） = 4.661，P < 0.05;可口食物，F（2,60） = 5.583，P < 0.01），然后是 Sidak 事后检验。ns，无显著差异，*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001，意味着 ± s.e. G 代表性图像显示 CNO （2 mg/kg） 注射在 LSNts 中诱导了稳健的 c-fos 表达 LacZ 对照中的神经元、vGAT 敲低和 Nts 敲低小鼠。比例尺：100 μm。H LacZ 对照 （n = 3）、vGAT 敲低 （n = 3） 和 Nts 敲低 （n = 3） 小鼠注射生理盐水和 CNO 后 c-fos + 细胞比率的统计分析。单因素方差分析 （F（5,12） = 854.6， P < 0.0001） 然后是 Tukey 事后检验。****P < 0.0001。指 ± s.e.m.
LSNts 神经元中的 vGAT 敲低对标准食物的摄入量没有影响，但显着增加了可口的高蔗糖食物的摄入量，表明 GABA 在基础条件下特异性抑制享乐喂养。使用类似的方法，我们设计了一种靶向 Nts 的 sgRNA 来敲低神经降压素肽。无论食物类型如何，神经降压素敲低对食物摄入量都没有影响。这些结果表明，在基础生理条件下，GABA 而不是神经降压素，信号传导介导 LSNts 神经元对享乐喂养的抑制作用。
接下来，我们检查了 vGAT 或神经降压素敲低对 LSNts 神经元化疗发生学激活的影响。通过 CNO 注射对 LSNts 的化学遗传学激活在所有三组小鼠中都诱导了强大的 c-fos 表达。在 LacZ 对照小鼠中，LSNts 神经元的化学遗传学激活抑制了食物摄入，与食物类型无关，与我们之前的结果一致。在 vGAT 敲低小鼠中，CNO 的给药也显著抑制了食物摄入，表明当 LSNts 神经元被强烈激活时，不需要 GABA 能传递。在 Nts 敲低小鼠中，CNO 注射仍然抑制了可口食物的摄入，但未能抑制食物的摄入，进一步表明 GABA 信号在抑制享乐喂养中具有特定作用。
综上所述，这些 CRISPR/Cas9 敲低实验表明，来自 LSNts 神经元的 GABA 和神经降压素信号转导都调节摄食，但它们在不同的活动水平上起作用。从 LSNts 神经元释放的 GABA 提供强直抑制，在基础水平抑制享乐进食，而神经降压素在强烈激活后进一步募集以抑制整体进食。
3.5 群体 LSNts 活性表现出与寻找食物和消费行为相关的双相反应
我们采用纤维光度法来评估 LSNts 神经元活动在摄食行为中的动态以及这些神经元在享乐进食中的参与。我们用表达基因编码的 Ca2+ 指示剂（GCaMP6）的 Cre 依赖性 AAV 转导 LSNts 神经元，并将光纤植入 Nts-ires-Cre 小鼠的 LS 中。使用光纤光度法，我们记录了在寻找食物和食用过程中来自 LSNts 神经元的群体 Ca2+ 信号。我们首先检查了 LSNts 神经元在提示条件递送小而固定体积的可口 Ensure 期间的活性。LSNts 神经元在摄食过程中表现出强大的 Ca2+ 动力学。然而，当 Ca2+ 信号与线索开始对齐时，该活动不受食物预测听觉线索或食物传递的调节。相比之下，当 Ca2+ 信号与提示后的第一次舔对齐时，我们观察到当动物接近食物喷口时，第一次舔之前 LSNts 活性增加。当动物开始食用食物时，这种活动增加之后，活动会更强劲地减少。
我们还在自由访问、自定进度的喂养方案中记录了 Ca2+ 信号，其中没有听觉线索，食物喷口始终可用。与提示条件喂养一致，我们观察到双相 LSNts 神经元 Ca2+ 动力学，在食物接近阶段表现出兴奋性反应，在食物消费阶段表现出抑制反应。只有当动物被喂食可口的 Ensure 而不是普通食物或稀释的 Ensure 时，才能观察到接近阶段的兴奋反应，这表明此活动不是由跑步或其他运动伪影引起的。然而，在食用阶段观察到的抑制反应在不同的食物类型中是相似的。当用水代替食物时，兴奋性和抑制性反应都减少了（图5D）。
图 5.LSNts 神经元的双相活性驱动食物寻找和消费。左图：在 Ensure 自由喂养期间 LSNts 神经元的群体 Ca2+ 活性。中图：省略食物时 LSNts 神经元的群体 Ca2+ 活性。右图：当动物头部固定并喂食 Ensure 时，LSNts 神经元的群体 Ca2 + 活性。垂直虚线：第一次舔。B 食物接近阶段 Ca2+ 活性曲线下面积 （n = 8）。单因素方差分析（F（2， 21） = 5.49，P < 0.01），然后是 Tukey 事后检验。*P < 0.05。表示±食物消费阶段 （n = 8） 中 Ca2+ 活性曲线下的面积。单向方差分析（F（2， 21） = 11.05，P < 0.01），然后是 Tukey 事后检验。**P < 0.01 和 ***P < 0.001。均值 ± s.e.m. D 上图：示意图显示将 AAV-DIO-ChR2 或 AAV-DIO-eNpHR 注射到 LS 中，用于 LSNts 神经元的光遗传学作。中图：显示 ChR2-mCherry 在 LSNts 神经元中的表达的代表性图像。下图：显示 eNpHR-EYFP 表达的代表性图像。E 在食物接近阶段 LSNts 神经元的光遗传学激活（蓝色，n = 4）或抑制（黄色，n = 6）对食物寻找和食物消费的影响。Wilcoxon 符号秩检验。*P < 0.05。F LSNts 神经元在食物消费阶段的光遗传学激活（蓝色，n = 4）或抑制（黄色，n = 6）对食物寻求和食物消费的影响。Wilcoxon 符号秩检验。*P < 0.05 和 **P < 0.01。
基于这些观察，我们假设 LSNts 神经元在接近阶段的兴奋反应可能代表了获得可口食物的动机，因此对驱动寻找食物和接近行为很重要，而消费阶段的抑制反应可能对整体完成行为至关重要。我们在一些试验中省略了食物输送来检验这一假设，发现第一次舔后的抑制反应消失了，而接近阶段的兴奋性反应被保留了下来。我们还检查了头部固定身体约束喂养程序中的 LSNts 活性，其中消除了寻找食物的机会；我们发现第一次舔之前的兴奋反应消失了，但食用过程中的抑制反应被保留了。
双相反应预测，接近阶段的 LSNts 神经元激活会促进食物寻找，而食物消费需要消费阶段的 LSNts 神经元抑制。我们之前的 TeNT 突触失活和化学发生学激活没有区分我们在体内测量的接近锁定和消耗锁定神经元动力学。利用光遗传学方法提供的毫秒级时间分辨率，我们专门纵了 LSNts 神经元在接近阶段与消费阶段的活性，并检查了其对食物寻找和食物消费的影响。
然后，我们在 LSNts 神经元中表达兴奋性视蛋白 ChR2 以进行光遗传学激活，并检查了不同喂养阶段时间精确的光遗传学激活的影响。食物接近阶段的光刺激显着缩短了潜伏期并提高了到达食物区的速度，表明在接近阶段激活 LSNts 神经元促进了寻找食物的行为。然而，这种光遗传学作对食物消耗没有影响。相比之下，LSNts 神经元在消费阶段的光遗传学激活严重抑制了食物消费，而它不会改变进入食物区的时间，但减少了在食物区花费的时间。接下来，我们在 LSNts 神经元中表达抑制性视蛋白 eNpHR，以实现时间精确的光遗传学沉默。一致地，在接近阶段对 LSNts 神经元的光遗传学抑制对完成行为没有影响，而消费阶段的光遗传学抑制强烈促进了总食物摄入量。
3.6 微型显微镜 Ca2+ 成像揭示了在进食过程中被激活或抑制的两组 LSNts 神经元
由于纤维光度测量记录总结了来自多个 LSNts 神经元的 Ca2+ 活性，因此两种可能的情况可能解释了 LSNts 神经元在进食过程中的双相反应。首先，LSNts 神经元的不同亚群被激活或抑制。其次，单个 LSNts 神经元群首先在食物接近时被激活，然后在食物消费过程中被抑制。为了区分这两种可能性，我们使用头戴式微型显微镜和植入式梯度指数（GRIN）透镜对自由移动的小鼠的单个 LSNts 神经元进行了体内 Ca2+ 成像(图6A,B)。
图 6.Miniscope Ca2+ 成像揭示了两个 LSNts 神经元群，它们在进食过程中被激活和抑制。A 示意图显示了使用头戴式微型显微镜对单个 LSNts 神经元进行 Ca2+ 成像。B Ca2+ 喂养过程中 10 个代表性 LSNts 细胞的动力学。比例尺：1 z 分数。在 Ensure 的自由喂养期间，290 个 LSNts 细胞的 C Ca2+ 反应与第一次舔对齐。大约 31% 的细胞被激活，32% 的细胞被抑制。D 活化细胞达到峰值的时间 （n = 88） 短于抑制细胞达到谷值的时间 （n = 86）。Mann-Whitney U 检验。P < 0.001。E 活化细胞的反应半宽 （n = 88） 短于抑制细胞的反应半宽 （n = 86）。Mann-Whitney U 检验。P < 0.001。F. 在食物缺乏条件下，130 个 LSNts 细胞的 Fa2+ 反应与第一次舔对齐。大约 40% 的细胞被激活，11% 的细胞被抑制。G. 在自由进食（左图）和食物遗漏（右图）条件下活化、抑制和无反应细胞的百分比。H 在 Ensure 自由喂养和食物遗漏试验期间，活化（左图）和抑制（右图）细胞的 Ca2 + 活性曲线下面积。Mann-Whitney U 检验。Ns，无显著差异。I. 抑制神经元（左图）和激活神经元（中图）的反应半宽和回合持续时间之间的相关性。右图：受抑制细胞的反应和行为之间的相关系数大于活化细胞的相关系数。Mann-Whitney U 检验。P < 0.001。 在 Ensure 自由喂食期间，激活（右图）和抑制（左图）细胞与最后一次舔对齐时，激活（右图）细胞的 J Ca2+ 反应。K. Ca2+ LSNts 神经元对蔗糖溶液和 Ensure （n = 4 只小鼠的 143 个神经元） 按 k-means 聚类分组。垂直虚线：第一次舔。LS Nts 神经元对 Ensure 和常规食物（来自 4 只小鼠的 n = 124 个神经元）的 L Ca2 + 反应按 k-means 聚类分组。垂直虚线：第一次舔。LS Nts 神经元对 Ensure 和水（来自 4 只小鼠的 n = 161 个神经元）的 M Ca2+ 响应按 k-means 聚类分组。垂直虚线：第一次舔。N 在自由喂食 Ensure、蔗糖溶液、普通食物和水期间鉴定的活化、抑制和无反应细胞的百分比。
我们在 LSNts 神经元中表达 GCaMP6s，并在自由访问、自定进度喂食可口的 Ensure 期间通过头戴式微型显微镜对单个细胞的 Ca2 + 活性进行成像。当动物接近并开始进食时（大约第一次舔），LSNts 神经元反应最灵敏；31% 的神经元被显著激活，32% 的神经元被显著抑制。被激活的神经元往往反应更快；它们在第一次舔前 0.3 ± 0.1 秒达到峰值，而受抑制细胞在第一次舔后 3.6 ± 0.3 秒达到最低点。活化细胞也显示出更窄的反应窗口，半宽（3.7 ± 0.3 s）明显小于抑制细胞（6.8 ± 0.4 s）。这两个神经元群时间动力学的这些差异可能有助于我们在纤维光度测量记录中观察到的双相反应。为了测试这种可能性，我们对每个细胞的反应进行了标准化并将它们相加；我们发现总和的人群反应表现出双相反应，这让人想起光度学响应。
我们通过在食物遗漏试验期间进行成像来检查激活和抑制的 LSNts 神经元群在摄食中的确切作用。当省略食物时，受抑制的 LSNts 神经元的百分比下降到 11%，而激活的神经元部分仍然很高（40%），表明受抑制的神经元主要参与摄食行为的完成阶段。在食物匮乏条件下，激活和抑制神经元的平均反应幅度与自由进食条件下相似。我们接下来检查了受抑制神经元的反应是否可以跟踪完成行为。我们分析了每项试验中 Ca2+ 反应与消耗性舔舐行为之间的关系，并观察到发作持续时间与抑制神经元群的反应持续时间之间存在显着相关性。在发作持续时间和反应半宽之间计算的相关系数对于抑制人群（0.69 ± 0.05）显著高于激活人群（0.28 ± 0.05），表明受抑制的 LSNts 群体在完成行为中的作用。为了进一步检查受抑制的神经元是否可以终止食物消耗，我们将对最后一次舔的反应进行了对齐，发现反应在最后一次舔后立即恢复到基线。因此，受抑制的 LSNts 神经元主要有助于食物的消费。
接下来，我们监测了 LSNts 神经元在喂食具有不同适口性的食物过程中的活性。测试的食物包括可口的 Ensure 或蔗糖溶液、中性普通食物或水。我们在同一会话中依次递送两种不同的食物，并使用对两种不同食物的反应进行无监督 k-means 聚类，以实现相同细胞对不同食物的反应的准确识别。我们比较了 Ensure 和蔗糖溶液自由喂养的反应，并观察到类似的反应。Ensure 和蔗糖都激活和抑制了相似比例的 LSNts 神经元。被 Ensure 和蔗糖激活和抑制的 LSNts 神经元基本是相同的亚群。然而，在喂食普通食物（11%）或水（9%）时，活化细胞的比例显着降低。这些结果表明，激活的 LSNts 神经元与食物的适口性更密切相关。
3.7 投射到结核核（TU）的 LSNts 神经元特异性调节享乐喂养
为了进一步探索 LSNts 神经元摄食调节的回路机制，我们使用 SynaptoTag AAV 系统地绘制了 LSNts 神经元的投射，该 AAV 共表达红色荧光蛋白 tdTomato 和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与突触小泡蛋白突触素融合。我们将 AAV-FLEX-tdTomato-T2A-突触素-EGFP 注射到 Nts-ires-cre 小鼠的 LS 中(图7A)。用 SynaptoTag AAV 感染的神经元的细胞质和轴突纤维中充满了 tdTomato，并将绿色荧光突触素定位到传出突触。通过这种追踪策略，我们发现 LSNts 神经元与多个大脑区域建立了主要的突触连接，包括外侧和内侧视前区（POA）、结节核（TU）、下丘脑前核（AHN）和下丘脑上核（SUM）。我们在 LSNts 神经元中表达 ChR2，并从切片中对 TU 神经元进行全细胞记录，以验证功能性突触连接。TU 中 LSNts 轴突末梢的短暂蓝光刺激从 ~50% 的记录的 TU 神经元中诱发了强大的毛霉毒素敏感 IPSC，证实 LSNts 和 TU 神经元之间的功能性 GABA 能突触连接。
图 7. LSNts 神经元投射到 TU 以调节享乐进食。示意图显示了 SynaptoTag AAV 策略，用于映射 LSNts 神经元的投影。B Nts-ires-Cre 小鼠 LS 中注射部位和病毒表达的代表性图像。C 代表性图像显示不同区域表达 tdTomato 的轴突和表达 GFP 的轴突末端。比例尺：200 μm。D 示意图显示了用于通过化学遗传学方法激活投射到一个特定下游靶标的 LSNts 神经元的病毒策略。每个 LSNts 预测的化学发生激活后标准食物 （E）、高蔗糖 （F） 和高脂肪 （G） 食物摄入量的量化。对照组，n = 7;LSNts→POA 组，n = 6;LSNts→AHN 组，n = 6;LSNts→TU 组，n = 7;LSNts→SUM 组，n = 8。双向方差分析（标准食物，F（4,68） = 2.854，P < 0.05;高蔗糖食物，F（4,58） = 9.145，P < 0.0001;高脂肪食物，F（4,58） = 4.541，P < 0.0001 ），然后是 Sidak 的事后检验。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和 ****P < 0.0001。平均值 ± s.e.m. H 上面板：示意图显示用于抑制 LSNts 的病毒策略 通过光遗传学方法投射到 TU 的神经元。下图：代表性图像显示了 eNpHR-EYFP 在投射到 TU 的 LSNts 神经元中的表达。比例尺：200 μm。I 投射 TU 的 LSNts 神经元的光遗传学抑制对规律食物摄入没有影响。EYFP 对照组，n = 5;eNpHR 组，n = 6。 双向方差分析 （F（1,18） = 0.2096，P > 0.05）。均值 ± S.E.M. J 对 TU 投射 LSNts 神经元的光遗传学抑制显着增加了 Ensure 的摄入量。EYFP 对照组，n = 5;eNpHR 组，n = 6。双向方差分析 （F（1,18） = 5.341，P < 0.05），然后是 Sidak 的事后检验。**P < 0.01。均值 ± s.e.m. K 显示 SUM 中神经降压素受体 1 （NtsR1） mRNA 信号的原位杂交结果的代表性图像。L 示意图显示了将 Nts 肽局部注入 SUM 的实验设计。M 对 SUM 给予生理盐水（灰色条，n = 8）或 Nts（蓝色条，n = 8）后 2 小时摄入标准食物的定量。Wilcoxon 符号秩检验。P < 0.001。对 SUM 施用盐水（灰色条，n = 8）或 Nts（蓝色条，n = 8）后 2 小时摄入高脂肪食物的 N 定量。Wilcoxon 符号秩检验。**P < 0.01。O 在自由喂养常规食物（左图）或 Ensure （右图）期间，通过纤维光度法记录的 LSNts→TU 的平均 Ca2+ 活性。上图：5 只小鼠的种群平均值。下图：个体小鼠的 Ca2+ 活性。P 在自由喂食常规食物（左图）或 Ensure （右图）期间，纤维光度法记录的 LSNts→SUM 电路的平均 Ca2+ 活性。上图：3 只小鼠的种群平均值。下图：个体小鼠的 Ca2+ 活性。
我们的电路追踪实验显示，LSNts 神经元投射到多个下游靶点，包括 POA、AHN、TU 和 SUM。虽然激活对 POA 的投射，但 AHN 和 SUM 抑制了整体进食，而 LSNts→TU 回路的激活特别抑制了可口食物的食用。这些结果表明 LSNts→TU 通路在调节享乐喂养中具有独特的作用。有趣的是，最近报道了结核核中的 SST 阳性神经元介导环境驱动的非稳态喂养，主要是享乐喂养。我们的 SynaptoTag 介导的顺行追踪揭示了 LSNts 神经元和 TU 中 SST 阳性神经元的突触钮扣之间的紧密接触。因此，一个合理的假设是 LSNts →TU 回路对抑制享乐喂养的影响至少部分是由 TU 中的 SST 神经元介导的。
3.8 LSNts 神经元或 LSNts→TU 通路的激活可防止高脂肪饮食诱导的肥胖
LSNts 神经元的激活抑制了进食，而 LSNts 神经元的作对能量消耗没有影响。我们想知道增强 LSNts 神经元活性是否会防止高脂肪饮食诱导的肥胖，我们用化学发生学方法长期激活了 LSNts 神经元。在对照小鼠中，引入高脂肪饮食后体重迅速增加，6 周后体重增加 37% ± 4%，而维持标准食物饮食的小鼠体重仅增加了 14% ± 1%。通过每日 IP 注射 CNO 对 LSNts 神经元进行化学遗传学激活，逆转了体重的增加（10% ± 1%）。使用交叉病毒策略，我们通过将 retroAAV-FLEX-FlpO 注射到 TU 中，将 AAV-fDIO-hM3D 注射到 Nts-ires-Cre 小鼠的 LS 中，选择性地转导 hM3D。LSNts→TU 的化学遗传学激活也显着降低了高脂肪饮食诱导的体重增加（21% ± 3%）。在旷场测试中，LSNts→TU 通路的慢性激活对运动活动或焦虑相关行为没有影响(图8C,D)。基于这些结果，LSNts 神经元或 LSNts→TU 回路的激活足以减少高脂肪饮食诱导的肥胖。
图 8.LSNts 神经元的激活可防止高脂肪饮食诱导的肥胖。A 示意图显示了高脂肪饮食诱导的肥胖模型中 LSNts 神经元慢性化学遗传学激活的实验设计。B 喂食标准食物（灰色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的对照小鼠（红色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的 LSNts：：hM3D 小鼠（绿色，n = 7）和 LSNts→TU：：hM3D 小鼠喂食高脂饮食（橙色，n = 9）的体重变化在几周内。双向方差分析 （F（3,22） = 13.74，P < 0.0001）。均值 ± SEM C 喂食标准食物（灰色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的对照小鼠（红色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的 LSNts：：hM3D 小鼠（绿色，n = 7）和 LSNts→TU：：hM3D 小鼠喂食高脂肪饮食（橙色，n = 9）的体重变化6 周后。双向方差分析（F（3,22） = 11.4，P < 0.001），然后是 Tukey 事后检验。*P < 0.05 和 ***P < 0.001。均值 ± s.e.m. D 喂食标准食物（灰色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的对照小鼠（红色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的 LSNts：：hM3D 小鼠（绿色，n = 7）和 LSNts→TU：：hM3D 小鼠喂食高脂肪饮食（橙色，n = 9）的平均运动活动。单因素方差分析 （F（3,22） = 0.15， P > 0.05）。均值 ± SEM E 喂食标准食物（灰色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的对照小鼠（红色，n = 5）、喂食高脂肪饮食的 LSNts：：hM3D 小鼠（绿色，n = 7）和 LSNts→TU：：hM3D 小鼠喂食高脂肪饮食（橙色，n = 9）。 单因素方差分析 （F（3,22） = 1.19，P > 0.05）。手段 ± SEM F LSNts 神经元调节享乐喂养和体重的分子和电路机制的工作模型。
四、讨论
在本研究中，我们在 LS 中确定了一组表达神经降压素的 GABA 能神经元，它们在调节享乐喂养中起关键作用。沉默 LSNts 神经元促进了享乐喂养，这是由 GABA 能投射到 TU 介导的。LSNts 神经元的激活抑制了整体食物消耗，这是由对 SUM、AHN 和 POA 的投射介导的。SUM 中的神经降压素信号传导足以抑制整体喂养。鉴于当前针对稳态回路的药物的不良副作用，确定参与调节享乐喂养的精确分子、细胞类型和电路可能有助于开发更好的抗肥胖药物。
LS 与各种生理过程有关，包括压力和焦虑。LS 包含许多分子不同的细胞类型。一个有趣的假设是，不同的细胞类型有助于不同的生理功能。表达 Crhr2 的 LS 神经元亚群（LSCrhr2）已被证明介导持续性压力诱导的焦虑行为。我们的结果揭示了 LSNts 神经元在调节享乐喂养而不是焦虑方面的关键作用，进一步支持 LS 中不同神经元亚型介导不同生理过程的假设。
LSNts 神经元是 LS 中表达神经降压素的 GABA 能神经元的一个子集。我们的结果表明，LSNts 神经元释放 GABA 以作用于下游脑靶标，因为 LSNts 神经元的短暂光遗传学激活诱发了强大的刺毒素敏感抑制性突触后电流。表达神经降压素的神经元的化学遗传学激活导致神经降压素释放到下游脑区。因此，LSNts 神经元同时释放经典神经递质 GABA 和肽神经降压素。使用 CRISPR/Cas9 介导的基因敲低，我们揭示了 GABA 和神经降压素信号转导在调节享乐喂养中的不同作用。在基础生理水平上，GABA 信号传导特异性抑制享乐喂养，因为 vGAT 敲除促进了可口食物的摄入，但不是普通食物的摄入。然而，LSNts 的化学发生学激活仍然抑制了 vGAT 敲除小鼠对可口食物和食物的摄入，表明神经降压素信号传导参与抑制整体进食。使用原位杂交技术，我们检测到 SUM 中神经降压素受体 1 的表达，它是 LSNts 神经元的下游投射靶标之一。此外，我们表明将神经降压素局部输注到 SUM 中抑制了可口食物和普通食物的摄入，表明神经降压素信号在 LSNts→SUM 通路中参与了抑制整体喂养。
最近的一项研究报道，LS 中的神经降压素神经元与食欲抑制有关。LSNts 神经元被应激激活，LSNts 的化学遗传激活导致一般的食物抑制，因此这项研究表明 LSNts 神经元在促进应激诱导的食物抑制中起重要作用。然而，由于下述原因，在我们的实验中观察到的厌食效应不太可能是由于压力诱导的食物抑制。首先，在我们的享乐喂养模型中，小鼠已经习惯了至少 3 天的可口饮食；因此，压力的影响可能很小。其次，TeNT 介导的 LSNts 突触沉默增加了高脂肪饮食小鼠的体重，但对喂养常规食物的小鼠的体重没有影响。这种差异不是归因于压力，因为两只动物都是在相同的条件下饲养的，并且具有相似的压力水平。相反，这一结果表明 LSNts 神经元在生理条件下限制了享乐进食。第三，使用体内微型显微 Ca2+ 成像，我们观察到 31% 的 LSNts 神经元被激活，而 32% 的神经元在自由进食可口食物时受到抑制。此外，我们还检查了同一组 LSNts 神经元对压力（足休克）的反应，发现大多数 LSNts 神经元（74%）被压力激活。因此，压力对 LSNts 神经元的强烈激活很可能促进神经降压素的释放以抑制整体食物摄入量。尽管 LSNts 神经元可能与食物抑制有关，但我们的研究表明 LSNts 神经元在无压力环境中调节享乐喂养方面发挥着重要作用。此外，我们的微型显微 Ca2+ 成像实验揭示了 LSNts 神经元在进食过程中的异质性，这在以前的文献中没有表征。
我们的电路追踪实验显示，LSNts 神经元投射到多个下游靶点，包括 POA、AHN、TU 和 SUM。虽然激活对 POA 的投射，但 AHN 和 SUM 抑制了整体进食，而 LSNts→TU 回路的激活特别抑制了可口食物的食用。这些结果表明 LSNts→TU 通路在调节享乐喂养中具有独特的作用。有趣的是，最近报道了结核核中的 SST 阳性神经元介导环境驱动的非稳态喂养，主要是享乐喂养。我们的 SynaptoTag 介导的顺行追踪揭示了 LSNts 神经元和 TU 中 SST 阳性神经元的突触钮扣之间的紧密接触。因此，一个合理的假设是 LSNts →TU 回路对抑制享乐喂养的影响至少部分是由 TU 中的 SST 神经元介导的。
我们的微型显微镜成像实验揭示了在进食过程中被激活和抑制的两群 LSNts 神经元。这一发现解释了在我们的光纤光度法实验中观察到的双相响应。与激活的 LSNts 亚群相比，抑制的 LSNts 亚群表现出更慢的响应潜伏期和更宽的响应窗口。这两个 LSNts 群体的时间动力学差异导致群体水平的双相反应。我们对神经元动力学和扰动实验的分析表明，受抑制的 LSNts 亚群对食物摄入具有主导作用。我们的结果还揭示了 LSNts 神经元的异质性，并强调了在生理过程中监测单个神经元活动的重要性。未来，一个重要目标是确定这些激活和抑制的 LSNts 亚群是否具有不同的分子谱，以及它们的突触输入和投射模式是否不同。
总之，我们的结果确定了一种新的 LS 回路，它在调节享乐喂养和肥胖中起重要作用。从 LSNts 神经元到 TU 的投射抑制了通过 GABA 信号传导的享乐进食，而从 LSNts 神经元到 POA、AHN 和 SUM 的投射抑制了整体进食。LSNts→SUM 通路中的神经降压素信号足以抑制整体摄食。这些发现拓宽了我们对享乐喂养背后的神经回路的理解，超越了经典的中脑边缘多巴胺能奖励系统，并将有助于开发由食物适口性驱动的过度喂养和由此导致的肥胖的干预措施。
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